Большая техническая энциклопедия
0 1 3 5 8
D N
А Б В Г Д Е Ж З И Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я
ДА ДВ ДЕ ДЖ ДЗ ДИ ДЛ ДО ДР ДУ

Диагностикум

 
Диагностикумы могут представлять из себя убитые клетки с выраженной чувствительностью к специфическим антителам, а также отдельные, хорошо изученные антигенные компоненты. Так у энтеробактерий известны Н -, О - и Vi-антигены, из которых первый термолабилен, второй и третий - термостабильны. На этом основано их выделение из клеток. Жгутиковый Н - антиген изолируют с помощью 0 2 % раствора формалина спустя сутки после его добавления и выдержки при 37 С; О - и Vi-антигены экстрагируют при повышенных температурах водой или другими растворителями. Такие антигены используют как таковые или в адсорбированном виде на эритроцитах, предварительно обработанных таннином или формалином.
Стандартные диагностикумы различных видов микробов выпускаются институтами микробиологии и рассылаются лабораториям в этикетированных ампулах, ; упакованных в коробки, к которым прилагается соответствующая инструкция по их применению. В случае самостоятельного приготовления бактериального диагности-кума обычно используют микробную культуру только в S форме, которая на чашке со слабощелочным мясо-пеп-тонным агаром образует гладкие, блестящие, с ровными краями колонии. Такая культура должна давать в физрастворе гомогенную взвесь и иметь полноценную антигенную структуру, и агглютинироваться до титра гомологичной диагностической сывороткой.
Специфичность антительного диагностикума проверяют в РТГТГА с гомологичным АГ. Используется контроль на отсутствие спонтанной гемагглютинации.
Кроме вышеназванных диагностикумов производят: единый бруцеллезный диагностикум из убитых фенолом бруцелл и подкрашенный метиленовым синим; гриппозный диагностикум в виде взвеси инактивированных формалином или мертиолатом вирионов в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов; диагностикум инак-тивированного вируса клещевого энцефалита ( суспензия мозга белых мышей, зараженных этим вирусом); эритроцитарный Vi-ди-агностикум, содержащий Vi-антиген Salmonella typhi, и О-диагно-стикум сальмонеллезный, включающий О-антиген из разных групп сальмонелл.
В лаборатории диагностикум приготовляют путем смешивания нескольких различных типов и штаммов бруцелл мелитензис, абортус бовис и суис. Для этого культуры бруцелл смывают с МПА гипертоническим раствором поваренной соли ( 12 % NaCl) с содержанием 0 25 % карболовой кислоты и приготовляют смесь густотой 20 млрд. Затем взвесь кипятят 10 мин и добавляют к ней 0 10 краски генцианвиолета, получая окрашенный диагностикум. Применение окрашенного АГ позволяет повысить контрастность образующегося агглютината бактерий, что значительно облегчает учет реакции.
РИГА со специфическими иммуноглобулиновыми эритроци-тарными диагностикумами; срок выполнения анализа - 1 5 - 2ч, положительный результат обычно отмечается при концентрации клеток холерных вибрионов не менее чем 105 в 1 мл.
Серологические реакции с антигенными диагностикумами позволяют выявить наличие в организме больных AT, а с антительными диагностикумами - АГ.
Для серологических реакций используют диагностикумы из риккетсий, вызывающих соответствующие заболевания.
При использовании для РЛА коммерческого эхинококкового диагностикума методика более простая: к разведениям сыворотки добавляют по 0 5 мл диагностикума.
Кроме вышеназванных диагностикумов производят: единый бруцеллезный диагностикум из убитых фенолом бруцелл и подкрашенный метиленовым синим; гриппозный диагностикум в виде взвеси инактивированных формалином или мертиолатом вирионов в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов; диагностикум инак-тивированного вируса клещевого энцефалита ( суспензия мозга белых мышей, зараженных этим вирусом); эритроцитарный Vi-ди-агностикум, содержащий Vi-антиген Salmonella typhi, и О-диагно-стикум сальмонеллезный, включающий О-антиген из разных групп сальмонелл.
Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритро-цитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.
В качестве АГ в этой реакции используют диагностикумы - взвеси заведомо известных убитых и в отдельных случаях живых микроорганизмов. Диагностикумы из убитых микроорганизмов в - форме весьма устойчивы, не теряют своих свойств в течение нескольких лет и не представляют биологической опасности.
К микробным иммунобиологическим препаратам относят вакцины, диагностикумы, аллергены.
Для этого лаборатория должна располагать необходимым набором лептоспирозных диагностикумов или живых культур лептоспир.
Диагноз листереллеза устанавливают положительной реакцией агглютинации с листереллезным диагностикумом и бактериологическим исследованием секрета конъюнктивы. Диагноз туляремии подтверждается специфической положительной реакцией агглютинации со второй недели заболевания и несколько раньше положительной кожной аллергической пробой.

Обнаружить в исследуемом материале вирусный антиген позволяет РОНГА с эритроцитарным антительным диагностикумом. Эту реакцию используют для экспресс-диагностики крымской геморрагической лихорадки, лимфоцитарного хориоменингита. Обнаружение и типирование вирусспецифического антигена достигается также путем применения ИФА и РОНГА на твердой основе. Положительные результаты указывают на наличие соответствующих антигенов.
АГ - используют живые или убитые жидкие культуры лептоспир ( диагностикум) в возрасте 7 - 10 дней без следов спонтанной агглютинации ( клубочки, узелки лептоспир) и посторонних примесей ( осадок фосфатов и пр.
Для серологической диагностики арбовирусных инфекций используют также РИФ, РИГА ( антигенный диагностикум), РОНГА, РРГ, ИФА, РИА.
В первом случае используют известную специфическую сыворотку, а во втором - стандартный лабораторный диагностикум АГ.
Ведущий метод диагностики заболевания - серологический, основанный на применении РСК, РА с диагностикумами из рик-кетсий Провачека и ОХ-штаммов протеев ( реакция Вейля-Феликса), непрямой РИФ. Диагностическое значение имеет 4-кратное нарастание титра антител в парных сыворотках. Ввиду позднего получения результата серодиагностики эмпирическую терапию заболевания начинают, не дожидаясь подтверждения диагноза.
Реакция считается положительной, если агглютинация полная () или почти полная (), диагностикум не дает спонтанной агглютинации в присутствии каждого компонента реакции и контроль специфичности АГ или AT положительный.
Серологические реакции с антигенными диагностикумами позволяют выявить наличие в организме больных AT, а с антительными диагностикумами - АГ.
Кроме вышеназванных диагностикумов производят: единый бруцеллезный диагностикум из убитых фенолом бруцелл и подкрашенный метиленовым синим; гриппозный диагностикум в виде взвеси инактивированных формалином или мертиолатом вирионов в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов; диагностикум инак-тивированного вируса клещевого энцефалита ( суспензия мозга белых мышей, зараженных этим вирусом); эритроцитарный Vi-ди-агностикум, содержащий Vi-антиген Salmonella typhi, и О-диагно-стикум сальмонеллезный, включающий О-антиген из разных групп сальмонелл.
В последние годы для определения токсигенности применяют высокочувствительные методы - ИФА с моноклональными антителами, РНГА с антительным эритроцитарным дифтерийным диагностикумом, причем ИФА и РНГА позволяют также обнаружить токсин в сыворотке крови.
После контакта компонентов смеси в течение 20 мин при комнатной температуре во все лунки вносят по 1 капле антительного эритроцитар-ного диагностикума и тщательно встряхивают. Через 1 5 - 2 0 ч инкубации при комнатной температуре по гемагглютинации учитывают результаты реакции. Титром сыворотки является ее наибольшее разведение, которое полностью тормозит реакцию гемагглютинации с 4 агглютинирующими единицами АГ.
При использовании для РЛА коммерческого эхинококкового диагностикума методика более простая: к разведениям сыворотки добавляют по 0 5 мл диагностикума.
Серологическая диагностика вирусных инфекций основана на выявлении в крови больного противовирусных антител в серологических реакциях с использованием специфических вирусных антигенов - диагностикумов или специфических тест-систем.
Более чувствительны и чаще дают положительные результаты другие методы: РИГА с эритроцитарными групповыми ( А, В, С, Д Е) и монорецепторными диагностикумами, а также ИФА, которые ставят с парными сыворотками в динамике заболевания. Антитела к О-антигенам выявляют начиная со второй недели болезни, а к К / - антигенам - в более позднем периоде.
Кроме вышеназванных диагностикумов производят: единый бруцеллезный диагностикум из убитых фенолом бруцелл и подкрашенный метиленовым синим; гриппозный диагностикум в виде взвеси инактивированных формалином или мертиолатом вирионов в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов; диагностикум инак-тивированного вируса клещевого энцефалита ( суспензия мозга белых мышей, зараженных этим вирусом); эритроцитарный Vi-ди-агностикум, содержащий Vi-антиген Salmonella typhi, и О-диагно-стикум сальмонеллезный, включающий О-антиген из разных групп сальмонелл.
Бруциллезная вакцина, вакцина против полиомиелита, вакцина против клещевого энцефалита, сибиреязвенная вакцина, сытно-тифозная и другие риккетсиозные вакцины, туляремийная вакцина, холерная вакцина, холерный бактериофаг, противочумная вакцина, риккетсиозные антигены Провагека и Музера, антиген и вакцина лихорадки Ку, ботулинический антиген, бруцел-лин, тулярин, энцефалитные диагностикумы, диагностические препараты орнитоза, пеиттакоза и лимфоцитарного хориоменингита.

В качестве АГ в этой реакции используют диагностикумы - взвеси заведомо известных убитых и в отдельных случаях живых микроорганизмов. Диагностикумы из убитых микроорганизмов в - форме весьма устойчивы, не теряют своих свойств в течение нескольких лет и не представляют биологической опасности.
Для результатов РА имеет значение концентрация микробной взвеси, поскольку в реакции необходимо обеспечить правильное и наиболее оптимальное соотношение антигена и антител. Стандартные диагностикумы бактерий кишечного семейства имеют концентрацию 3 млрд, клеток / мл, туляремии - 5, холеры - 5, бруцеллеза 10 млрд, мл по оптическому кишечному стандарту. При постановке пробирочной РА конечная концентрация микробов в пробирках с реакцией должна составлять 500 млн. / 1 млрд, микробных тел в 1 мл.
В качестве диагностикума используют взвесь убитых нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенную генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым. Для реакции Райта и Хеддльсона выпускается единый цветной бруцеллезный диагностикум, содержащий антигены трех патогенных для человека бруцелл.
Разработанные варианты тест-систем необходимы для применения в наркологической и судебно-медицинской практике, клинической биохимии. С помощью таких диагностикумов удобно проводить скриннинговые обследования населения.
Схема разведения сыворотка в подсобном ряду пробирок. При втором варианте смешивания АГ и AT к разведениям сыворотки, разлитой в пробирки по 0 5 мл, добавляют по 0 6 мл антигена, взятого в концентрации 1 млрд, микробных тел / мл по оптическому стандарту. В результате добавления диагностикума бактерий во всех пробирках объем будет равен 1 мл.
Реакцию сопровождают контролем сыворотки и диагностикума.
Кровь из пальца в виде толстой капли наносят на предметное стекло и добавляют в нее равный объем дистиллированной воды, чтобы вызвать гемолиз. Рядом с кровью помещают каплю туляремийного диагностикума, обе капли смешивают стеклянной палочкой. У больных туляремией в серопозитив-ном периоде ( при титре антител 1: 100 и выше) агглютинация происходит немедленно. У лиц, перенесших туляремию, в течение длительного времени в крови обнаруживаются специфические агглютинины.
На основании полученных результатов разработан комплект нормативно-технической документации по созданию новых отечественных им-мунохимических тест-систем для экпресс-анализа наркотиков в биологической жидкости человека. Комплект документов, представленный в НЦ ЭГТССЛС для проведения приемочных технических испытаний наборов диагностикумов включает: проект технических условий ( ТУ), проект инструкции по применению, проект патентного формуляра, проект карты технического уровны, протокол предварительных испытаний, проект лабораторного регламента.
Самым быстрым и специфическим методом диагностики является постановка внутрикожной пробы с орнитозным аллергеном. В качестве аллергена используется аллантоисная культура мозгового штамма В возбудителя орнитоза или ( лучше) тканевый диагностикум. Предварительно кожу обрабатывают спиртом и подкожно вводят 0 1 мл аллергена на внутренней поверхности предплечья с одновременным контролем на другой руке. Гиперемия и инфильтрат обычно исчезают через 36 - 48 ч, но иногда держатся длительно и даже оставляют бурую пигментацию.
После этого в опытный ряд пробирок, включая и контроль АГ, добавляют по 0 1 мл бактериального диагностикума, который предварительно ресуспендируют встряхиванием. Штатив с пробирками берут в руки или устанавливают в шуттель-аппарат и энергично встряхивают в течение 10 мин. Сразу же после перемешивания во все пробирки заливают по 0 8 мл физраствора и производят учет и оценку результатов РА. Реакцию учитывают в агглюти-носкопе или с помощью лупы.
Благодаря использованию минимального количества АГ ( 2 нейтрализующие дозы) реакция высокочувствительна. Количество нейтрализующих доз в антигенном препарате определяют с помощью РИГА, при этом делают серийные 2-кратные разведения АГ в 1 % - м растворе нормальной сыворотки кролика и в лунки вносят антительный эритроци-тарный диагностикум. Нейтрализующей дозой АГ считают его максимальное разведение, дающее полное склеивание сенсибилизированных эритроцитов.
В лаборатории диагностикум приготовляют путем смешивания нескольких различных типов и штаммов бруцелл мелитензис, абортус бовис и суис. Для этого культуры бруцелл смывают с МПА гипертоническим раствором поваренной соли ( 12 % NaCl) с содержанием 0 25 % карболовой кислоты и приготовляют смесь густотой 20 млрд. Затем взвесь кипятят 10 мин и добавляют к ней 0 10 краски генцианвиолета, получая окрашенный диагностикум. Применение окрашенного АГ позволяет повысить контрастность образующегося агглютината бактерий, что значительно облегчает учет реакции.
Антитела к возбудителям брюшного тифа, паратифов А и В обнаруживаются в сыворотке крови больных с 8 - 10-го дня заболевания. Полученную сыворотку последовательно разводят ( табл. 2.11) в 6 параллельных рядах пробирок от 1: 100 до 1: 1600 и вносят ОН - и О-диагностикумы в пробирки ( в 2 ряда соответственно): брюшнотифозный, паратифозный А и паратифозный В. Для контроля антигена каждый диагностикум в той же дозе вносят в 1 мл ИХН, а для контроля сыворотки используют сыворотку в разведении 1: 100 без добавления диагно-стикумов. С целью получения О-диагностикумов суспензии соответствующих культур кипятят или обрабатывают спиртом; ОН-диагностикумы получают после обработки формалином.
За отчетный период работа, запланированная в рамках настоящего проекта, выполнена полностью. На основе направленного синтеза и наработки специфических иммунохимических реагентов разработаны иммуно-химические методы для экспресс-анализа опиатов, бензодиазепинов, кан-набиноидов в биологической жидкости человека. Приготовлены опытные серии образцов новых диагностикумов. Образцы успешно прошли приемочные испытания. Проведены клинические испытания тест-систем на предмет обнаружения опиатов. Подготовлен комплект нормативно-технической документации и методические рекомендации по созданию промышленной партии систем. Для проведения дальнейших испытаний препаратов и внедрения их в практику клинического обследования населения необходимо продолжение финансирования работ. На следующем этапе предполагается продолжение исследований по разработке и оптимизации метода экспресс-анализа низкомолекулярных наркотиков в биологической жидкости человеа на основе реакции латексной агглютинации. На основе синтеза и наработки специфических иммунохимических реагентов будут разработаны методы изготовления диагностических тест-систем для определения следующих классов соединений - опиатов, барбитуратов, канна-биноидов, кокаина, бензодиазепинов, эфедрона. Приготовлены опытные серии образцов новых диагностикумов, и подготовлен комплект нормативно-технической документации по созданию примышленной партии систем.

В качестве диагностикума используют взвесь убитых нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенную генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым. Для реакции Райта и Хеддльсона выпускается единый цветной бруцеллезный диагностикум, содержащий антигены трех патогенных для человека бруцелл.
В лунки полистироловых планшетов или агглютинационные пробирки вносят по 0 025 мл 1 % - го раствора нормальной сыворотки кролика и делают серийные 2-кратные разведения исследуемого материала. Затем во все лунки добавляют по 0 025 мл иммунной сыворотки, планшет встряхивают и оставляют на 30 мин при 37 С или на 1 ч при комнатной температуре. Далее во все лунки добавляют по 0 025 мл антигенного диагностикума, встряхивают планшет и оставляют на 2 ч, после чего учитывают результаты.
На предметное стекло наносят слева каплю дистиллированной воды и к ней добавляют одну каплю свежевзятой крови больного, перемешивают стеклянной палочкой до просветления ( полного гемолиза) капли крови. В контрольную каплю ( справа) берут одну каплю дистиллированной воды или физраствора и одну-две капли диагностикума. Капли перемешивают как 01бычно с легким подогреванием и через 3 - б мин учитывают результат реакции.
Тщательно обезжиренное предметное сухое стекло размерами 18X24 см расчерчивают восковым карандашом на квадраты величиной 3X3 или 4X4 см. По горизонтали должно быть шесть квадратов. Затем в микропипетку набирают исследуемую сыворотку и последовательно вносят в 5 квадратов, начиная с первого, следующие дозы ее: 0 08, 0 04, 0 02, 0 01, и 0 02 мл. Далее к каждой капле сыворотки ( 1 - 4 квадрат) и в шестой квадрат ( за исключением пятого квадрата) приливают по 0 03 мл диагностикума. Затем в пятый квадрат ( контроль сыворотки) и в шестой ( контроль АГ) добавляют 0 03 мл физраствора. Смеси ингредиентов перемешивают одной стеклянной палочкой последовательно в 6, 4, 3, 2 и 1 квадратах, отдельной - в пятом квадрате. Затем стекло с пробами берут в руки, круговыми покачиваниями продолжают перемешивать компоненты и при этом слегка подогревают смеси в течение 2 - 3 мин, держа стекло высоко над пламенем горелки. Температура стекла с реакциями не должна превышать 45, Ее определяют путем прикосновения тыльной стороны руки к нижней поверхности стекла. При этом все время наблюдают за ходом реакции. В случаях положительной реакции уже в первые минуты появляются в первых квадратах зерна агглютината.
Кроме классического выделения культуры, можно применять укороченные методы диагностики, которые являются ориентировочными. К ним относятся: 1) исследование нативного мазка; 2) метод макроагглютинацин со специфической противохолерной О-сывороткой при доращивании нативного материала на пептонной воде; 3) иммунофлюоресцентная диагностика. Определенное значение имеют серологические методы исследования: обнаружение антител в сыворотке крови больных или носителей ( РА), выделение антигена в испражнениях методом РПГА с эритроцитарпым диагностикумом, сенсибилизированным антителами иммунной холерной сыворотки.
Для диагностики сифилиса выпускают кардиолипиновый антиген для реакции микропреципитации. Этот антиген включает 3 очищенных липида: 0 03 % 1 3-дифосфатглицерина ( кардиолипин), 0 27 % фосфатидилхолина ( лецитин) и 0 9 % холестерина в абсолютном этаноле. Препарат выпускают в ампулах по 2 мл. Инактивированные вирусные диагностикумы используют в реакциях связывания комплемента, нейтрализации и торможения гемагглютинации.
 
Loading
на заглавную 10 самыхСловариО сайтеОбратная связь к началу страницы

© 2008 - 2014
словарь online
словарь
одноклассники
XHTML | CSS
Лицензиар ngpedia.ru
1.8.11